Ouchterlony

Partie 4 : Risque infectieux et protection de l'organisme

"D'autres leucocytes, les lymphocytes B, sécrètent dans le sang des molécules nommées anticorps capables de participer à la neutralisation des microorganismes et favorise la phagocytose.

Chaque type d'anticorps est spécifique d'un antigène. Une personne est dite séropositive pour un anticorps déterminé lorsqu'elle présente cet anticorps dans son sang."

Cette manipulation permet de démontrer qu'un individu malade produit des "éléments" (les anticorps),qui circulent dans le sang, et qui réagissent en présence des antigènes du microorganisme qui l'infectent. Elle permet aussi d'illustrer la notion de spécificité anticorps-antigène et peut être l'occasion d'amorcer une réflexion sur  les raisons moléculaires de cette spécificité. (même si cet aspect n'est pas exigible au programme).

C'est une méthode d'immunodiffusion sur gel : les solutions déposées dans les puits creusés dans le gel diffusent de façon homogène  dans  toutes  les  directions  autour  du  puits.  Deux  auréoles  de  diffusion  peuvent  donc  entrer  en  contact lorsqu'elles  ont  suffisamment  progressé.  Cette  zone  de  contact  reste  invisible  s'il  n'y  a  pas  de  réaction  entre  les  deux solutions.  Quand  il  y  a  réaction  entre  les  solutions,  il  se  forme  un  arc  de  précipitation  visible  à  l'œil  nu.  Celui-ci  est  dû  à l'interaction  entre  de  nombreux  anticorps  et  les  antigènes  spécifiques.

On cherche à identifier, parmi  4  personnes, un individu ayant été en contact avec la méningite et en particulier la Méningite à méningocoques (Neisseria meningitidis).
L'individu ayant été en contact avec le méningocoque a  produit des anticorps  capables de réagir face aux antigènes de cette bactérie.

La spécificité d'un anticorps étant liée à sa capacité de liaison avec l'antigène, le test d'immunodiffusion, ou test d'Ouchterlony, permet la mise en évidence de cette liaison antigène-anticorps et donc de repérer l'individu séropositif au méningocoque.

Pour ce test :

 

1- Matériel enseignant

 

-Préparer une solution de soude à 0, 4 g pour 10 ml d'eau distillée (simulation du sérum qui va réagir).(prête d'avance pour les élèves)
Remarque : L'utilisation par les élèves de soude doit être soumis à précaution : le rappel des règles de sécurité à adopter lors de manipulations s'impose.

 

-Préparer une solution de sulfate de zinc à 0, 8  g pour 10 ml d'eau distillée(ou 0,6g pour 10ml) (simulation des antigènes de micro-organismes)(prête d'avance aussi).Si la solution de ZnSO4 est un peu blanchâtre, la laisser reposer et n'utiliser  que le mélange limpide.


- Préparer un gel d'Agar à couler dans une boîte de Pétri pour test d'Ouchterlony
Peser 1, 5 g d'agar-agar et le verser dans 100 ml d'eau distillée froide.(on réalise environ 15 boîtes).  Faire chauffer doucement en remuant bien tout le temps jusqu'à apparition de bulles mais ne pas faire bouillir  (le mélange devient limpide). Couler ensuite l'agar-agar chaud sur une hauteur de 3  mm environ dans les bouchons, petits pots ou les boîtes de Pétri.(toute la gélose est utilisée). Laisser refroidir jusqu'à la prise de l'agar-agar.(Les puits s'évident mieux si on passe les boîtes,quelques minutes,  au réfrigérateur avant leur utilisation ).





2- Exemple du matériel proposé aux élèves

1 - Réaliser des puits à l'aide de la paille :

Il faut réaliser un puits central et répartir 4  puits tout autour. Les puits sont équidistants d'environ 5mm.

Appliquer l'embout de la paille dans le fond de la boîte et tourner doucement. Le morceau de gélose peut rester dans la paille ou pas. (Essuyer la paille entre chaque puits). On évide alors le puits avec un cure-dent  ou en retournant la boîte et en la tapant d'un coup sec sur la paillasse. 

Remarque   : On peut aussi utiliser une seringue appliquée dans la gélose et aspirer en même temps celle-ci. On peut améliorer la qualité du puits en adaptant un petit tuyau de polypropylène ou de verre sur la seringue (le puits sera de meilleure qualité, car l'embout de la seringue a une épaisseur importante.)

Il est possible de proposer un gabarit de perçage que les élèves placent sous la boîte de pétri.


Ce gabarit présente un double intérêt :

- assurer l'équidistance des puits (une distance entre deux puits supérieure à 5 mm augmenterait le temps de diffusion des solutions jusqu'à leur contact).

- permettre l'identification des sérums placés dans les puits par transparence en s'affranchissant du marquage au crayon sur la boîte .

2 - Réalisation des dépôts

1-  Si le gabarit de perçage n'est pas utilisé, marquer sur les bords de la boîte de Pétri à l'aide d'un marqueur, la disposition des produits à déposer dans les puits permettant de révéler la réaction de l'anticorps étudié avec les différents antigènes proposés.

 

.2- En utilisant les micropipettes des petits flacons, placer dans les puits périphériques 1 goutte des différentes solutions de sérums A, B, C et D

 

3- Mettre dans le puits central, la solution S

 

Remarque : ne pas faire déborder, ne pas laisser de bulles,  ni endommager le gel d'agar-agar.

 

4- Fermer la boite.

 

 

"> L'arc de précipitation apparait entre les puits S et D. Le sérum D contient des anticorps ayant réagit avec les antigènes du méningocoque. La personne recherchée est donc l'individu auquel appartient le sérum D.